導 讀
城市供水系統中的耐氯真菌為面向直飲的高品質飲用水供應帶來了新的挑戰。以某城市供水系統為研究對象，借助培養法、宏基因組測序等方法對水廠不同處理工藝出水和二次供水中真菌的數量和群落結構進行了測定分析。經過水廠凈水工藝處理，真菌菌落數有效降低；但相比出廠水，二次供水水箱中的真菌數量出現上升，表明存在真菌再生長風險。出廠水和二次供水中的真菌以根瘤菌屬、壺菌屬、曲霉屬和鐮刀菌屬為主。曲霉是兩水廠出廠水中檢出頻率和相對豐度最高的致病真菌，3月份最高豐度可達25.19%，建議應作為供水系統重點控制的對象。紫外裝置對二次供水中耐氯真菌的數量和致病真菌豐度具有明顯的控制效果。
引用本文：趙恒軒,王圣,張天陽，等. 城市供水系統中真菌群落賦存規律解析［J］. 給水排水，2023，49（12）：14-20.
為了解城市供水系統種真菌的污染現狀，本研究全面考察了中國東部某城市供水系統中真菌的賦存規律，致病真菌的種類和分布，及不同處理工藝的控制效果，以期為供水系統中真菌污染風險的識別與控制策略提供新的見解。
01
材料與方法
1.1 水樣采集
水樣采集自中國東部某市水廠A和水廠B。水廠A采用長江水源的水庫原水，水廠B采用太湖下游湖泊的水庫原水。水廠A凈水工藝過程依次為原水（DWSS1-RW）-混凝沉淀（DWSS1-SD）-砂濾（DWSS1-SF）-臭氧/活性炭（DWSS1-BAC）-氯胺消毒出水（DWSS1-FW）；水廠B凈水工藝過程依次為原水（DWSS2-RW）-混凝沉淀（DWSS2-SD）-砂濾（DWSS2-SF）-臭氧/活性炭（DWSS1-BAC）-納濾（DWSS2-NF）-氯胺消毒出水（DWSS2-FW）。取樣點還包括距離水廠A 3 km處的某二次供水設施水樣（DWSS1-STW）和二次供水紫外處理后出水，包括慢流速（DWSS1-UV-M），中流速（DWSS1-UV-Z）和快流速（DWSS1-UV-K），分別對應高紫外劑量（44 mJ/cm²）、中紫外劑量（33 mJ/cm²）和低紫外劑量（22 mJ/cm²）。每處采樣點使用無菌容器采集20~40 L水樣，立即帶回實驗室處理，或置于4 ℃條件下保存。
1.2 主要試劑、培養基及儀器
DNA提取試劑盒DNeasy PowerSoil Pro Kit（QIAGEN，美國），氯硝唑孟加拉紅瓊脂培養基Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar（DRBC，青島海博生物技術有限公司），小型離心機Eppendorf 5430 R（Eppendorf，德國），粉碎研磨儀TL-48R（上海萬柏生物科技有限公司），測序儀Illumina NovaSeq/Hiseq Xten（Illumina，美國）。
1.3 真菌平板法計數和篩選
將100 mL水樣通過0.45 μm無菌濾膜，隨后將濾膜置于DRBC培養基正中，濾膜與培養基之間無氣泡。將培養基置于25 ℃恒溫培養箱中避光培養，每兩天觀察一次，在第4天記錄濾膜上的菌落數（單位CFU/100 mL）。
1.4 水樣總DNA提取和高通量測序
將樣本水樣通過0.22 μm無菌濾膜，隨后按DNA提取試劑盒操作說明提取總DNA。文庫構建使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit，使用Illumina NovaSeq/Hiseq Xten測序平臺進行宏基因組測序。
1.5 測序數據質控與分析
使用fastp軟件(https://github.com/OpenGene/fastp版本0.20.0）對讀取3′和5′端的適配器序列執行質量裁剪。剪切后去除長度小于50bp、平均堿基質量值小于20和N個堿基的讀數，同時保留高質量的雙端讀數和單端讀數。使用將非冗余基因集的氨基酸序列與NR數據庫進行比對（BLASTP比對參數設置期望值e-value為10-5）。
02
結果與分析
2.1 供水系統中真菌的數量變化規律
在12月、2月-6月分別對水廠A及二次供水設施、水廠B的各工藝出水進行了平板計數法檢測。如圖1所示，水廠A和水廠B的原水中，真菌的數量最高可達390 CFU/100 mL。在不同的季節，原水中的真菌數量變化差異較大。在冬季（2月和12月）水廠A和B原水中的真菌數量分別達到最大，而不是微生物活躍的夏季，這可能和取樣時的降水情況有關。真菌的最適生長溫度在15~25 ℃，但降水可能沖刷地表導致土壤中的真菌進入水庫原水中，造成短期真菌數量的上升。經過混凝沉淀、砂濾、臭氧生物-活性炭和氯胺消毒處理后，出廠水中的真菌數量得到了有效的控制。
圖1 供水系統真菌數量變化
水廠A出廠水中真菌菌落數為0~8 CFU/100 mL，水廠B出廠水中真菌菌落數為0~1 CFU/100 mL。
如圖1a所示，經過管網輸配后，水廠A供水的某二次供水水箱中真菌的數量有所上升。例如12月二次供水水箱出水的真菌數量高達79 CFU/100 mL，5月真菌數量高達96 CFU/100 mL，表明真菌在供水管網系統中可能存在再生長的風險。經過二次供水設施裝備的紫外消毒處理后，12月和5月出水中真菌數量可分別降至31 CFU/100 mL和1 CFU/100 mL。因此紫外消毒未來可能作為水廠或二次供水控制真菌污染的潛在消毒技術。
2.2 可培養真菌的分離和鑒定
如表1所示，通過連續采樣檢測，在供水系統中共分離出了11種真菌，包括9種霉菌和2種酵母菌。霉菌來自青霉（Penicillium）、木霉（Trichoderma）、枝孢霉（Cladosporium）、擬青霉（Paecilomyces）、曲霉（Aspergillus）等5個屬，酵母菌來自囊擔菌屬（Cystobasidium）和何德霉（Hortaea）屬。其中Aspergillus（曲霉屬）包括許多風險較高的條件致病真菌。青霉、木霉、枝孢霉、曲霉屬中的大部分真菌具有產生嗅味物質的能力，可能會引起供水管網中嗅味物質的再次生成。此外曲霉屬中的大部分還具有生成真菌毒素的能力。因此，霉菌是供水系統中需要控制的首要目標。
表1 可培養真菌的種類
2.3 真菌群落結構解析
通過宏基因組（相對定量）對供水系統中真菌群落進行解析。如圖2所示，飲用水不同處理工藝對水中真菌的群落結構具有重要的影響。供水系統中真菌的門水平分布主要由子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和擔子菌門（Basidiomycota）。其中子囊菌門包含較多已知對人健康有危害的真菌屬種，且其相對豐度隨著水廠處理工藝從原水到出廠水具有逐漸升高的趨勢，在水廠A和水廠B中的變化趨勢相近。這可能由于子囊菌門的大多數真菌能夠形成具有緊實細胞壁和堅固結構的真菌孢子（繁殖子實體，直徑約1~10 μm），因此能夠穿過水廠的物理或化學處理屏障。
圖2 水廠真菌門水平相對豐度變化
圖3所示為水廠真菌屬水平相對豐度變化。水廠A豐度最高的真菌菌屬主要包括根瘤菌屬（Rhizopus）、壺菌屬（Batrachochytrium）、曲霉屬（Aspergillus）、噬根菌屬（Rhizophagus）和鐮刀菌屬（Fusarium）。水廠B豐度最高的真菌菌屬主要包括曲霉屬（Aspergillus）、根瘤菌屬（Rhizopus）、鐮刀菌屬（Fusarium）、假裸囊菌屬（Pseudogymnoascus）和球囊霉屬（Glomus）。水廠A臭氧-生物活性炭工藝出水中根瘤菌屬（Rhizopus）和曲霉屬（Aspergillus）的相對豐度顯著增大，這可能和生物活性炭池的微生物泄漏情況有關。在氯胺消毒后，二者的相對豐度得到有效的降低。在水廠B中，納濾出水呈現出菌落豐度均勻分布的特點。經過氯胺消毒后，曲霉屬（Aspergillus）相對豐度出現了明顯的增大。這可能是由于某些種類曲霉菌具有較強的耐氯性，因此在穿過消毒屏障后，其相對豐度得到了一定的富集效果。例如土曲霉和煙曲霉滅活2-log所需的CT值為946~1404 mg·min/L，而花曲霉僅為57 mg·min/L。這些具有較高耐氯性的且具有一定致病風險的耐氯真菌，可能對飲用水的生物安全性產生較大威脅。
圖3 水廠真菌屬水平相對豐度變化
圖4所示兩水廠出廠水真菌豐度對比同樣表明，水廠B出廠水中的曲霉屬（Aspergillus）相對豐度（75%）為水廠A（25%）的3倍。雖然水廠B增加了納濾深度處理工藝，但是出廠水中對某些致病真菌的控制效果依然不佳。
圖4 兩水廠出廠水真菌豐度對比
圖5為水廠A供水（距離水廠A 3 km）的某二次供水水箱及紫外處理后的真菌門水平和屬水平變化。經過紫外處理，捕蟲霉門（Zoopagomycota）的相對豐度快速降低，而毛霉門（Mucoromycota）的相對豐度上升，在中紫外劑量下最高，表明毛霉門真菌可能對紫外有一定抗性。但隨著紫外劑量升高，
圖5 二次供水真菌門水平和屬水平變化
毛霉門真菌豐度下降至40%，表明高紫外劑量下對毛霉門真菌存在控制效果。在屬水平上，集珠霉屬（Syncephalis）經紫外處理后相對豐度快速降低，而Bifiguratus屬占比升高。在二次供水設施中，除紫外消毒以外，二氧化氯、臭氧消毒等方式對微生物有較強的殺滅效果，這些不同消毒方式對真菌的控制效果及對群落結構的影響，未來有待更多研究加以評估。
2.4 致病真菌分布
通過冗余分析（RDA），考察了供水系統中5種常見致病真菌的相對豐度與原水環境因子之間的關系，如圖6所示，環境變量與真菌之間夾角的余弦值代表了其之間的相關性。若為銳角，便是正相關?？梢钥闯觯畯SA原水中鐮刀菌、木霉和青霉與濁度、氨氮、UV254及UV272的正相關性較高。水廠B原水中青霉、瓶霉、木霉、曲霉和鐮刀菌同樣與濁度、氨氮、UV254及UV272的正相關性較高。這4個指標均為判斷原水水質好壞的常用基本指標。而致病真菌的相對豐度與pH、溫度、總有機碳、硝酸鹽-氮、亞硝酸鹽-氮、總氮等指標基本呈負相關關系。某些病原真菌在其宿主體內環境下生長繁殖速度更快，例如在較低的pH條件下，可誘導真菌孢子快速萌發，因此原水中致病真菌的相對豐度與pH呈負相關關系。然而其他因素與致病真菌之間呈負相關關系的內在機理還需進一步研究。
圖6 原水致病真菌和水質指標的相關性關系
表2列舉了水廠A和水廠B的出廠水在2月、3月和5月9種致病真菌的相對豐度分布。在所有致病真菌中，曲霉的相對豐度最高，A出廠水中為5.1%~9.7%，B出廠水中為4.2%~25.2%，3月最高。其次為鐮刀菌，A出廠水中為0.9%~2.6%，B出廠水中為2.0%~6.4%，2月最高。曲霉屬和鐮刀菌屬能夠引發過敏、過敏性肺炎、鼻炎和哮喘，某些甚至會引起免疫功能損傷，并對免疫功能低下者造成侵襲性感染。美國阿肯色州大學醫學院認為鐮刀菌屬可能是真菌侵染的環境來源。
表2 出廠水致病真菌相對豐度分布
另一項研究表明，醫院的水系統可能是醫院內免疫功能低下患者曲霉菌病的一個重要來源。
03
結 論
調查了中國東部某市城市供水系統中真菌的賦存情況。兩水廠可以將真菌數量從原水的最高390 CFU/100 mL降低至出廠水的 <10 CFU/100 mL，但經過管網輸送，二次供水水箱內的真菌數量有所上升。通過篩選分離出了11種真菌，以霉菌為主。供水系統中真菌主要由子囊菌門（Ascomycota）、毛霉門（Mucoromycota）和擔子菌門（Basidiomycota）組成，相對豐度最高的包括根瘤菌屬（Rhizopus）、壺菌屬（Batrachochytrium）、曲霉屬（Aspergillus）和鐮刀菌屬（Fusarium）等。二次供水的紫外裝置可以有效控制真菌數量，并對真菌群落結構造成較大影響。原水中致病真菌與濁度、氨氮、UV254和UV272等指標具有較強的正相關性。飲用水廠出廠水中曲霉屬和鐮刀菌屬是相對豐度最高的致病真菌。
